【用户文章】Nano Today：单细胞测序技术揭示SiO2 NPs干扰肺部免疫微环境 | 单细胞专题

期刊名称：Nano Today

影响因子：18.962

发表时间：2021年8月

发表单位：苏州大学

所用组学：Single-cell RNA sequencing

今天这篇文章通过单细胞转录组测序技术探究SiO₂纳米粒子对免疫微环境的影响--扰乱正常的肺部微环境，其特征是长时间的 T 细胞耗竭，增加恶性细胞转移和存活的可能性。本文是由苏州大学发表，下面是对本文的详细解读。

目的

在纳米医学的背景下，全身给药的无机纳米材料不可避免地在正常组织和器官（如肝、肺、脾）中积累，可能会扰乱正常的免疫微环境。本研究通过采用单细胞转录组测序技术探究了全身给药的二氧化硅纳米粒子（SiO₂ NPs）对正常免疫微环境的影响。

方法

应用单细胞转录组测序（ScRNA-seq）技术评估了系统给药SiO₂ NPs后对肺、肝和脾脏的免疫微环境的影响。结合qPCR，透射电镜，免疫荧光染色等验证实验和单细胞转录组分析，为SiO₂ NPs如何影响免疫反应提供了证据，对改善公众健康以及为我们的免疫系统功能提供了新的见解。

结果

本研究中，作者研究了系统给药SiO₂ NPs后肺、肝和脾脏的免疫微环境。利用ScRNA seq技术，观察到使用SiO₂ NPs后，肺部T细胞数量显著减少，同时增加了产生il -17的γδ T细胞数量，减少了αβ T细胞数量，以及表达更多T细胞功能障碍标志物。作者进一步发现，这种效应是由骨髓来源的细胞在肺中积累引起的，这些细胞被SiO₂ NPs特异性富集。此外，在多种小鼠模型中，发现SiO₂处理的小鼠更容易发生肺肿瘤转移。作者的研究结果表明，系统给予SiO₂ NPs可能会扰乱以T细胞功能障碍为特征的正常肺部微环境，从而增加肺组织中恶性细胞存活的可能性。

01背景介绍

在过去的十年中，纳米技术的发展为疾病的诊断和治疗带来了巨大的可能性。然而，在正常的组织器官（如肝、肺、脾）中，系统给药的无机纳米材料（其中大多数是耐降解的）不可避免地积累，可能在无意中影响或干扰局部免疫微环境。目前还不清楚当接触纳米材料时，局部免疫系统是如何改变的。与此同时，对正常组织中免疫微环境干扰的后果了解甚少。

SiO₂ NPs因其良好的化学性质、热稳定性和生物相容性而成为最有前途的纳米材料之一。且其作为癌症治疗工具的广泛应用和有效性已被许多文献证实。更重要的是，超细二氧化硅颗粒已被批准用于人体临床试验。考虑到二氧化硅也是空气颗粒物的组成部分，因此了解它如何影响免疫反应对于改善公众健康以及为我们的免疫系统功能提供新的见解是必不可少的。

02研究结果

1、SiO₂纳米粒子的体外毒性研究

根据之前建立的方法合成SiO₂ NPs。透射电镜显示SiO₂ NPs的尺寸约为30 nm（图1a）。流体动力学尺寸和Zeta电位分别为78.5±11.64 nm和−13.8±0.625 mV（图1b，c）。能量色散X射线能谱图表明，Si和O构成了纳米粒子（图1d）。

为了研究SiO₂ NPs的细胞毒性，将不同浓度的样品（经内毒素试验确认为无菌）孵育巨噬细胞（RAW 264.7）、树突状细胞（DC 2.4）、黑色素瘤癌细胞（B16-Luc）或T细胞（Jurkat T），结果表明SiO₂ NPs在一定浓度范围内对各种细胞均无明显的细胞毒性（图1e）。一旦纳米颗粒进入体内，巨噬细胞是通过内吞或吞噬作用吸收它们的主要细胞。

作者进一步评估了SiO₂ NPs对巨噬细胞的免疫作用的影响。发现SiO₂ NPs可促进ROS生成，增加TNF-α、IL-6、NF-κB表达，并使巨噬细胞M1极化，诱导无菌炎症反应（图1f-h）。Annexin V/PI双染色进一步表明，SiO₂ NPs可诱导巨噬细胞轻度凋亡，且呈剂量依赖性，而对树突状细胞的影响相对忽略，这也与巨噬细胞吞噬更多的SiO₂ NPs有关（图1i，j）。有趣的是，在SiO₂ 处理的RAW 264.7细胞中PD-1表达显著升高（图1k-p）。此外，作为TLR4-NF-κ b信号通路的抑制剂，TAK-242处理后PD-1的表达明显受到抑制（图1q-u），表明SiO₂ NPs诱导巨噬细胞活化，巨噬细胞PD-1表达部分依赖于激活TLR4-NF-κb信号通路。巨噬细胞上表达的PD-1在免疫中起免疫抑制作用。

研究图1：SiO₂纳米粒子的体外毒性研究

2、系统给药SiO₂ NPs影响肺、肝、脾的免疫微环境

为了进一步研究SiO₂ NPs是否影响体内微环境，作者将无菌的SiO₂ NPs静脉注射到小鼠体内。结果显示，第1天SiO₂ NPs主要在肝脏中积累，其次是脾脏和肺，15天后逐渐减少（图2a）。

因此，作者重点研究了SiO₂ NPs积累对肺、肝和脾脏三个主要器官的免疫微环境的影响。结果发现，在注射SiO₂ NPs后的第1天，肺组织的炎症细胞因子水平略有增加，并在第15天保持相对较高的水平（图2b-d）。趋化因子的产生伴随着免疫细胞的富集。促炎趋化因子CXCL5，CCL2，CCL3和CCL20被富集，这些趋化因子具有调节造血细胞迁移的作用（图2e-h）。

作者进一步通过研究肺的免疫环境发现骨髓细胞的数量显著增加。相反，T细胞数量在第1天增加，而在第15天显著下降（图2i-n）。而肺内T细胞的减少和髓系细胞的积累与包括巨噬细胞和T细胞在内的肺组织中PD-1表达的显著升高有关。此外，其他T细胞衰竭标志物和活化诱导细胞死亡相关蛋白也增强（图2o-s）。以上，系统给药SiO₂ NPs会干扰肺免疫微环境。

作者通过在肝脏和脾脏以及外周血中进一步探究了这种干扰现象。结果表明，系统给药SiO₂ NPs能明显改变肺、肝、脾中T细胞的免疫微环境。有趣的是，SiO₂ NPs虽然在肺部积累量最低，但免疫微环境的改变却最显著。

图2：系统给药SiO₂ NPs可影响肺部免疫微环境

3、系统给药SiO₂ NPs可增加肺中髓系细胞与T细胞的比例

为了阐明SiO₂ NPs对免疫微环境的干扰，作者对肺组织进行单细胞转录组测序探究了第15天SiO₂ NPs处理的小鼠免疫微环境。通过构建肺组织的免疫细胞图谱，鉴定出粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、T细胞、树突状细胞、B细胞和NK细胞（图3a）。与未处理组相比，SiO₂ 处理组的单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和T细胞数量呈现显著差异（图3b），且骨髓细胞数量明显增加，而T细胞数量明显减少（图3c-e）。

在癌症的背景下，中性粒细胞和单核细胞都被报道作为MDSCs，可以抑制适应性免疫反应。巨噬细胞还能促进肿瘤表达，控制细胞周期和DNA复制的基因。此外，火山图显示，大量上调基因为免疫抑制相关基因（图3f）。其中，S100a8、S100a9、Lyz2、Il1b、Acod1和Mmp9基因上调可有效的抑制抗肿瘤免疫（图3g）。通过KEGG富集分析发现与单核细胞、粒细胞和巨噬细胞迁移、激活和分化相关的基因集富集（图3i-k）。作者发现巨噬细胞的激活和促肿瘤相关基因的表达增加，可能可以促进免疫抑制微环境的形成，促进肿瘤生长。

图3：系统给药SiO₂ NPs可增加髓系细胞与T细胞的比例

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作者进一步对T细胞进行了细胞亚型分类，鉴定出两种特异性T细胞。定量分析显示αβ T细胞数量显著减少，而γδ T细胞数量增加（图4a-c）。经SiO2 处理后，γδ T细胞相关基因Il17a、Il17f、Il22、Il1r1、Il23r和Ptgs2的表达也上调（图4d）。有报道称γδ T细胞通过诱导血管生成、促进血管内皮生长因子的产生、促进转移等发挥促肿瘤细胞生长的作用。

作者发现分泌il -17的TH17+细胞的比例急剧增加（图4f）。TH17+细胞多为γδ T细胞型（γδ17 T细胞）。有报道称TH17+ T细胞通过自身发挥免疫抑制功能促进肿瘤生长。同时，作者还发现了许多与效应T细胞和初始 T细胞相关的下调基因（图4g），这表明T细胞数量的减少与终端分化TH17+表型相关联，降低了它们对抗新挑战（如癌细胞）的弹性。此外，与T细胞功能失调性表型相关的标志物Pdcd1、Ctla4、Lag3、Havcr2的表达在肺中表达最为显著（图4g），与TH17、TH1和TH2分化相关的KEGG基因集的富集也证明了上述结果（图4h）。总之，SiO₂ NPs处理使肺组织呈现免疫抑制微环境，导致T细胞功能障碍，调节性TH17+细胞诱导和效应T细胞消除。

图4：系统给药SiO₂ NPs可抑制T细胞在肺中的功能

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4、系统给药SiO₂ NPs诱导肺组织恶性细胞存活

作者为了进一步研究系统给药SiO₂ NPs对肺肿瘤转移的影响，建立了多种小鼠肿瘤模型。在系统给药SiO₂ NPs15天后，静脉注射2 × 10⁵个B16F10-Luc肿瘤细胞建立实验性肺转移瘤模型（图5a）。与未处理的小鼠相比，SiO₂ NPs处理显著加快了肿瘤细胞从肺外周循环的流入，甚至部分小鼠出现肝转移（图5b）。结果进一步表明，肺和肝中的肿瘤细胞明显多于未处理小鼠（图5c-g）。此外，在CT26结肠模型（图5h-m）和4T1乳腺肿瘤模型（图5n-s）中也得到类似的结果。虽然未见肝转移，但与对照组相比，SiO₂ NPs处理的肺肿瘤病变明显增加。

为了进一步探索系统给药SiO₂ NPs是否促进肺转移，作者建立了自发转移模型。作者发现注射SiO₂ NPs并不影响皮下肿瘤的生长，然而，与未处理的小鼠相比，肺转移出现得更快（图5u-w）。这些研究结果表明，系统给药SiO₂ NPs可能会不经意地干扰肺部的免疫微环境，其特征是T细胞衰竭基因。这些因素削弱了免疫系统的能力，尤其是T细胞，对转移部位的肿瘤细胞的反应能力。

图5：系统给药SiO₂ NPs可诱导恶性细胞在肺组织中存活

最后，作者探究了系统给药SiO₂ NPs所引起的肺免疫微环境的干扰持续时间。发现单次系统注射20mg /kg剂量的SiO₂ NPs 120天后，几乎所有的SiO₂ NPs都从体中去除（图6a）。组织学分析显示，与未处理的小鼠相比，小鼠的主要器官没有显著差异（图6b）。但仍有大量的常驻骨髓细胞存在于肺中，包括巨噬细胞、MDSCs （图6c-e）。相应的，T细胞的数量随着PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4的表达而下降，这也反映了T细胞的衰竭（图6f-j）。上述数据表明，系统给药SiO₂ NPs至少可干扰肺免疫微环境120 天。与未处理小鼠相比，SiO₂ 处理小鼠的肺肿瘤定植速度更快（图6k，l）。

图6：长期系统给药SiO₂ NPs可扰乱肺免疫微环境。

03研究结论

本研究中，作者首次利用单细胞转录组测序技术研究了正常组织中SiO₂ NPs系统给药后的免疫微环境景观。结果表明，系统给药SiO₂ NPs可能会干扰以T细胞功能障碍为特征的肺内微环境，从而增加恶性细胞存活的可能性。作者描述了系统应用SiO₂ NPs的潜在风险，其相关的风险-收益比应作为未来治疗癌症患者的参考。

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杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文已见刊50余篇，影响因子平均15+。

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